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鞠熀先教师课题组在细胞表面糖链的原来的地点检查评定攻略研商再次得到着重進展【www.488sb.com】

二月 11th, 2020  |  智能生活

www.488sb.com,2016年9月16日,化学领域国际顶级期刊德国《应用化学》在线发表了我校刘震教授研究团队提交的题为“Probing
low-copy-number proteins in a single living cell”的论文(Angew. Chem.
Int. Ed., 2016, DOI: 10.1002/anie.201608237)。

发现新的生物标志物和发展新的分子探针,在分子水平上探索生命过程和疾病发生发展机制是现代生物医学领域前沿研究方向之一。

神经节苷脂是细胞表面糖链的一种重要分子形态,包含一个或多个唾液酸末端寡糖链,通过神经酰胺部分的烷烃链嵌在细胞膜上,在高特异性酶作用下增减糖单元,动态地在细胞表面合成和降解,调节细胞结构、细胞粘附和信号传导,并作为微生物毒素、细菌和病毒的受体,与细胞生命过程密切相关。神经节苷脂异常的糖基化通路与遗传性疾病、肿瘤组织恶性转化等疾病相关。不同亚型的神经节苷脂异常过表达还与肿瘤的类型和进程密切相关。因此,筛查细胞表面的神经节苷脂对揭示其相关的生物过程和潜在的肿瘤进程具有重要的意义。

发展高灵敏度、高选择性的新型光学探针是生命分析化学的一个重要前沿领域。中国科学院化学研究所活体分析化学重点实验室研究员马会民课题组科研人员长期从事该方面的研究,并取得一系列成果
(Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 10916; Angew. Chem. Int. Ed.,
2016, 55, 14728; Angew. Chem. Int. Ed., 2017, 56,
15319)。近年来,该课题组还应邀对光学探针的各种设计方法及其发展趋势进行了系统的评述
(Chem. Rev., 2014, 114, 590;Chem. Sci., 2016, 7, 6309)。

单细胞分析技术是揭示细胞的行为、功能及微观不均一性的核心工具。低拷贝数蛋白质(单个细胞中含量低于1000个分子的蛋白质)在细胞信号和基因表达调控等细胞功能中起到重要的作用。尽管已有多个单细胞技术(如毛细管电泳、质谱和微流控芯片等)用于分析单细胞内蛋白质的表达,但由于灵敏度低的原因这些方法通常仅适用于高表达的蛋白质。另一方面,单细胞活体分析在发育生物学和细胞质量控制分析等方面具有重要意义。但是,很多单细胞分析技术需要向细胞内引入标记试剂,改变了细胞内的化学组成。该研究团队提出了基于活体微萃取和表面等离激元光学检测相结合的,称为“表面等离激元免疫夹心法”的新颖方法,可以检测单个活细胞和活体动物中的低拷贝数蛋白。该方法的原理为,将表面修饰了单克隆抗体或分子印迹聚合物的金基微萃取探针在显微操作平台的辅助下插入到单细胞中,在很短的时间内将特定的目标蛋白质专一高效地萃取到探针表面,微萃取探针拔出并经清洗后用修饰了能识别目标蛋白质的抗体或硼亲和配基的银基纳米拉曼探针标记,从而形成萃取探针-目标蛋白质-拉曼标签三明治型复合物结构,当用激光束照射以上三明治型复合物表面时发生表面等离激元光学效应,银基拉曼标签产生表面增强拉曼散射,金基微萃取探针产生表面等离子波则进一步增强银基拉曼标签的表面增强拉曼散射信号,从而大大增强检测灵敏度,检测限可达单分子水平。微萃取的尺寸极小,活体萃取过程对细胞的损伤很小,萃取后细胞仍存活。利用该方法,实验揭示,碱性磷酸酶和survivin在正常细胞内不表达或有限表达,而在癌细胞中为高表达;而且,癌细胞过度的传代会导致survivin的表达降低。此外,该研究团队还将该分析技术赋予了中国文化元素,利用针灸针制备出微萃取探针,用于活体动物组织内的低拷贝数蛋白质的测定。该单细胞分析技术在癌症诊断与预后、细胞质量控制、发育生物学、干细胞研究及脑科学等多个领域中具有重要的应用前景。

在国家自然科学基金委、科技部和中国科学院的支持下,中科院化学所活体分析化学院重点实验室上官棣华课题组研究人员长期致力于生物标志物和分子探针的研究。近年来,他们利用Cell-SELEX技术获得了系列识别特定肿瘤细胞的核酸适配体分子探针(Plos
One 2014, 9, e100243;Biomaterials 2014, 35, 6998; Angew. Chem. Int.
Ed. 2016, 55, 3914;Talanta 2019, 194,
437),研究了核酸适配体识别机理,建立了新的生物标志物检测方法(Sci. Rep.
2017, 7, 15467;ACS Appl Mater Inter 2018, 10,
2312),发展了基于SILAC的定量蛋白质组学技术的核酸适配体蛋白靶标的鉴定方法Mol.
Cell. Proteomics 2015, 14,
2692),为基于Cell-SELEX技术的生物标志物发现奠定了基础。

我校生命分析化学国家重点实验室的鞠熀先教授课题组从事细胞表面糖链研究已经十年,在细胞表面糖基的原位检测方法学研究领域提出了奠基性的成果(J.
Am. Chem. Soc. 2008, 130, 7224;Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6465;
Anal. Chem. 2010, 82, 5804; Anal. Chem. 2012, 84, 1452;Chem. Sci. 2015,
6, 3769)。近两年该研究组发展了特定蛋白质上糖基的多种原位检测方法(Chem.
Sci. 2016, 7, 569,Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 5220; Angew. Chem.
Int. Ed. 2017, 56,
8139)。近期,他们针对神经节苷脂研究的迫切需求,设计了一对具有非破坏性提取和疏水收集功能的浮力微球探针,实现了细胞表面神经节苷脂的定量、亚型筛查与再生分析,于2017年12月4日在线发表(Angew.
Chem. Int. Ed. DOI: 10.1002/anie. 201710984)。

羟基自由基
是人体内一种重要的活性氧物种,具有极强的反应活性,能够损伤蛋白质、DNA及脂类等重要生物分子,进而引发神经性疾病、癌症等。目前,广泛认可的生物体内-OH产生途径是Fenton反应
(Fe2+ +
H2O2)。考虑到细胞内溶解O2的浓度远远高于H2O2的稳态浓度,因此铁自氧化过程
(Fe2+ +
O2)可能也在-OH的产生上扮演着重要角色。然而,由于缺乏灵敏的分析方法来检测铁自氧化过程中产生的痕量-OH,这一过程的重要性往往被人们所忽视。最近,在国家自然科学基金委、科技部和中科院的大力支持下,该课题组研制出了第一个可以检测这种无需外加H2O2的铁自氧化过程中痕量-OH的光学探针
。该研究利用了-OH对芳香化合物独特的羟基化作用,以有效避免其它活性氧物种
(如OCl-、ONOO-)
的干扰;同时,由于-OH具有亲电性,所以在芳香环上引入强的供电子甲氧基,提高了探针对-OH的捕获能力。探针与-OH反应后,通过电子重排,导致π-共轭体系扩展并产生强的近红外荧光发射,具有高的分析灵敏度。该探针已成功用于活细胞内铁自氧化过程中痕量-OH的荧光成像分析,其优越的分析性能和广泛应用将有助于理解铁自氧化过程的生理学及病理学作用。相关工作发表在
Angew. Chem. Int. Ed. (2018, 57,
12830-12834)上。

该论文的第一作者为博士生刘佳同学。在研究工作中,该团队前期建立起的分子印迹技术(Angew.
Chem. Int. Ed., 2013, 52, 7451-7454; 2014, 53, 10386-10389; 2015, 54,
10211-10215; Chem. Sci., 2014, 2014, 5,
1135-1140)经受住了挑战性任务的考验。陈洪渊院士课题组为该研究工作提供了重要的技术支持。该研究得到国家杰出青年科学基金、国家重大科研仪器研制项目和国家重大科学研究计划的经费支持。

神经突的生长是神经发育的关键,识别神经突的分子探针对于评估神经生长发育、药物的神经毒性和促神经再生作用等是必不可少的。为了获得神经突探针,王林林博士生和邴涛副研究员等建立了神经突-SELEX方法,并筛选获得了一个结合神经突的DNA核酸适配体yly12,鉴定yly12的分子靶标为神经细胞粘附分子L1,以yly12为分子探针发现L1CAM在多种肿瘤细胞中高表达。他们成功将yly12应用于活细胞之间三维神经突网络的成像和正常脑组织切片上的神经纤维染色;并发现yly12对细胞间神经突的生长具有一定抑制作用。yly12可作为神经突的分子探针用于神经科学研究(J.
Am. Chem. Soc. 2018, 140,
18066)。目前正在进行L1CAM表达与肿瘤的相关性研究。

该研究工作由助理研究员陈云龙为第一作者,鞠熀先教授为通讯作者于10月25日投稿,11月13日预录用。他们构建的一对功能化浮力微球包括提取探针和收集探针。提取探针以马来酰亚胺修饰的二氧化硅浮力微球为基底,在其上共价结合具有核酸内切酶切割位点和硼酸末端的DNA分子,通过硼酸与细胞表面唾液酸的共价识别作用,将细胞表面包含唾液酸的生物分子通过浮力提取。在核酸内切酶的作用下,被提取的生物分子被释放到溶液中,并由十八烷硅烷化的收集探针通过疏水作用收集其中的结合有核酸碎片的神经节苷脂,进一步利用体外杂交链反应对神经节苷脂进行荧光定量。用唾液酸剪切酶切除收集探针上收集的神经节苷脂中的唾液酸残基,通过荧光标记的凝集素识别残留聚糖,该工作发展了细胞表面神经节苷脂亚型的筛选鉴定方法,并第一次提出三种神经节苷脂亚型。利用提取探针对细胞表面唾液酸包含物进行不同程度地提取,可用这两种探针对细胞表面神经节苷脂的再生过程进行监测。与已有的神经节苷脂分析方法相比,该方法无需细胞破碎及其它预处理,首次实现了细胞表面神经节苷脂的定量筛查、亚类鉴定和再生分析,为揭示神经节苷脂相关的生命过程提供了重要工具。

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新型羟基自由基光学探针与荧光成像

图1. 表面等离激元免疫夹心法的单细胞分析原理示意图

图1 核酸适配体yly12用于三维神经突网络成像

图1. 功能浮力微球探针的制备和细胞表面神经节苷脂定量分析原理

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蛋白的二聚化是生物体内一种重要的生理现象,蛋白的二聚体往往是蛋白质发挥生物学功能的重要形式。但是由于难以获得完整、稳定的蛋白二聚体用于制备分子探针,到目前为止,没有单一分子探针可以用于细胞或组织上蛋白二聚体的原位检测,严重制约了蛋白二聚体的功能研究。邴涛副研究员和沈璐瑶博士生等利用cell-SELEX技术,首次筛选获得了特异性识别碱性磷酸酶异源二聚体、而不识别单体的核酸适配体BG2。利用该核酸适配体,发现碱性磷酸酶异源二聚体在数种肿瘤细胞上高表达;用核酸适配体成功实现了碱性磷酸酶异源二聚体的分离纯化以及荷瘤小鼠中高表达碱性磷酸酶异源二聚体的肿瘤的原位成像。碱性磷酸酶的同工酶广泛分布在生物体内,但是碱性磷酸酶异源二聚体在组织和细胞中的分布和功能尚未知,核酸适配体BG2可为揭开碱性磷酸酶异源二聚体的奥秘以及肿瘤检测提供重要分子工具(Adv.
Sci. 2019,
1900143)。目前正在研究碱性磷酸酶异源二聚体作为肿瘤标志物的可行性研究。

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图2.
单细胞活体微萃取示意图、单细胞内碱性磷酸酶的空间分布、单细胞分析结果和细胞裂解液分析结果比较、检测正常肝细胞内6个survivin分子所得拉曼信号及不同细胞系中碱性磷酸酶及survivin的分析结果对照

研究人员在该领域的研究成果,将加速cell-SELEX技术在生物标志物发现领域的广泛应用,将促进新的生物标志物的发现。

图2. 细胞表面神经节苷脂亚型的鉴定原理和分析结果

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(化学化工学院 科学技术处)

图3.
基于针灸针萃取探针的表面等离激元免疫夹心法检测种植了不同细胞的小鼠内碱性磷酸酶及survivin

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核酸适配体BG2特异性地识别碱性磷酸酶异源二聚体的示意图及其用于肿瘤原位成像。

(化学化工学院 科学技术处)

活体分析化学院重点实验室

2019年4月30日

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